用于离子电渗透皮给药的可生物降解镁电极

大中至正

▶前言
可生物降解金属在经皮给药中的应用受到了有限的关注，金属微针和电渗透已经得到了深入研究。在这我们提出镁作为一种突出的候选物，用作金属微针电极。其金属特性使得可以施加电压来增强带电药物分子的扩散，而镁腐蚀过程中产生的氢气则阻止了其作为电极的应用。

镁微针电极是使用纳秒激光制备的，并且在电渗透过程中测量了施加电位时产生的氢气量。根据施加电位增强药物扩散的效应和氢气生成的阻碍效应，建立了适用于电渗透的合适电位范围。对猪皮肤上的镁微针进行了染料渗透测试，证明了镁微针和电渗透的联合效应。
染料在较高电压下的迁移减少，这是由于过多的氢气生成和针尖腐蚀，两者都使得带电染料分子沿着镁微针表面的扩散更加困难。这些结果表明了镁微针电极在经皮给药中具有最佳的电位范围，兼顾了施加电场和电渗透过程中的气泡生成。
经皮给药是一种无痛的将分子药物传递到皮肤内的方法。它提供了一种可能的替代传统药物给药方法，如口服或皮下注射，克服了包括过敏反应、感染风险、针刺恐惧、出血和对患者心理压力等各种限制，并通过微循环直接吸收，对pH要求、对酶的敏感性以及复杂的代谢要求较少。

由于外源分子通过皮肤的自然渗透极其缓慢，需要采用先进的经皮给药策略，以最大限度地提高药物通量，但最小限度地侵入皮肤。
金属微针是满足这些矛盾要求的最佳选择：作为一种微创方法，几乎无痛，微针可以创建微通道，药物可以通过这些通道进入皮肤。微针可以与电渗透机制轻松结合，有效地输送带电药物分子。金属微针使用生物相容金属如不锈钢或钛，具有足够的机械强度和优异的电导性，可以施加电场到带电药物分子上。
尽管具有这些优点，如果微针在皮肤内破损的话这些金属可能会引起过敏反应、局部过敏性炎症或通过释放毒素离子引起色素沉着。

基于镁的材料是克服上述挑战的良好选择，特别是微针破损的危险，并已经在骨科、牙科和心脏病学等领域积极研究其安全性。作为金属材料，它们具有足够的强度穿透皮肤，并可用作电极。由于在体内产生严重腐蚀并生成氢气，与传统电化学电极材料迥然不同，尚未被广泛考虑作为微针电极用于电渗透。
我们研究了镁作为离子导入微针的电化学电极的应用：对施加电压条件下镁阳极和镁阴极上的氢气生成行为进行了全面分析，并结合猪皮肤模型中染料迁移的情况，确定了增强经皮给药的最佳电位范围。
这些研究对于克服将电化学活性的镁应用于电极所带来的困难至关重要：药物输送的效率与电场强度成正比，但高电压可能会引发细胞或皮肤损伤。剧烈的氢气生成可能会阻碍药物分子沿着镁微针表面和周围微通道的迁移，精确控制电位的优化是必不可少的。

▶一、实验
将镁板抛光至2000目，并在绝对乙醇的超声浴中清洗。使用纤维纳秒激光器将抛光的镁板切割成6×2的微针阵列，每根针的长度和宽度分别为1000μm和500μm。激光系统的脉冲持续时间为8纳秒，中心波长为1070纳米。
激光功率为20瓦，斑点直径为60μm，扫描速度为1000毫米/秒。每根针通过推入直销而竖立起来，并在使用前分别在绝对乙醇和丙酮的超声浴中进行消毒。
猪皮肤用于镁微针的穿透和染料渗透测试。猪样品从当地肉店获得，并立即冷冻在-80°C，直到进一步分析。实验前将猪样品浸泡在1×磷酸缓冲盐溶液，中室温解冻，以防止表面干燥。用去离子水彻底清洗猪样品，去除皮下脂肪，并将其切成3±0.2毫米厚度的2×2厘米板片。

PDMS树脂用作猪样品上的镁微针的支撑结构。将PDMS树脂与固化剂按比例10:1混合。使用真空设备除去PDMS中的气泡，并在70°C下固化过夜。将红色荧光染料溶液制备为乙醇中溶解罗丹明B。将镁微针浸入染料溶液中，并以距离3毫米的距离放置在猪样品上。
用手指按压镀涂的镁微针一段时间，使其穿透猪样品，然后用PDMS压紧固定1小时。用数码相机验证了镁微针标记的猪皮肤，并使用3D显微镜研究了单次穿刺的深度。
使用Mg矩形电极进行电位水平测量、H2生成测试和H2O2生成测试。通过使用纤维纳秒激光器将抛光的板材切割成1.5×1厘米的矩形形状，并分别在绝对乙醇和丙酮的超声浴中进行消毒。

使用电位计测量电极的电位，其中Mg电极、Ag/AgCl和Pt板分别作为工作电极、参比电极和计数电极，在1×PBS溶液中进行测量。将工作电极连接到直流电源作为阳极或阴极。以相同方式测量镁合金电极的电位。
将Mg矩形电极连接长电线，并将连接部分完全包裹在商业环氧树脂中。两个电极分别作为阳极和阴极连接到直流电源，并浸泡在1×PBS溶液中。系统被倒置的漏斗覆盖，Mg电极在施加电压下浸泡期间产生的氢气被收集在漏斗的柱状部分。观察体积变化并转换为生成的氢气量。
将两个Mg矩形电极作为阳极和阴极连接到直流电源，在1×PBS溶液中施加电压1小时。在特定时间采集50μL的工作样品和50μL的H2O2标准溶液，绘制H2O2浓度的线性曲线，并将其加入96孔黑板中。

向每个孔中加入50μL荧光氢过氧化物测定试剂盒的混合物，孵育10分钟。使用荧光显微板读数器测量荧光强度，激发波长为540纳米，发射波长为590纳米。将荧光强度值转换为生成的H2O2浓度。
将猪皮样品涂覆红色染料溶液。两个Mg微针被放置在涂有染料的猪皮样品上，距离为3毫米，并连接到直流电源上，分别作为阳极和阴极。手动推动Mg微针一段时间，使其能够渗透进入猪皮样品，用PDMS进行压力固定，在施加电压下固定1小时。
用4%的甲醛固定处理过的猪皮样品30分钟，嵌入冰冻切片剂介质中，并在零下80摄氏度保存过夜。使用单刃刀切割冰冻样品，获得Mg微针插入部位的横截面图像。

分析插入了Mg微针的猪皮样品的横截面图像，以定量分析离子导入过程中的染料渗透。每个图像在Mg微针阳极附近的特定区域均匀切割，并使用Image J软件分析染料分布的面积。结果以平均值±标准偏差的形式呈现。使用Origin软件进行一元方差分析，并使用Tukey's测试进行统计分析。
在离子导入过程中插入猪皮样品后，将Mg微针用去离子水清洗并干燥。在成像之前，将Mg微针样品涂覆一层薄膜的铂。使用扫描电子显微镜在10 kV的加速电压下进行成像。使用连接到SEM设备的EDS分析Mg微针的元素组成。
▶二、结果与讨论
使用纤维纳秒激光器轻松制备了Mg微针电极。为了实现成功的经皮药物传递，微针应能够至少渗透皮肤150微米。由于皮肤渗透的平均深度仅为总针长的10%-30% ，Mg微针设计为了分析Mg微针的渗透行为，使用猪皮样品进行测试。

将Mg微针浸泡在染料溶液中以进行可视化，并插入猪皮样品中。在移除Mg微针后，经过1小时，猪皮样品显示出用罗丹明B标记的微通道。使用3D显微镜检测猪皮上的单次穿刺深度。在Mg微针插入1小时后，凹陷标记的深度约为290微米，约占总微针长度的30%。可以得出结论，纯Mg微针具有足够的强度穿透皮肤并形成用于药物输送的微通道。
应用电位范围的确定：作为Mg微针电极的电离穿透电流应用中，根据施加的电压，有必要分析每个电极上的电化学反应，如Mg的腐蚀和氢气产生。由于微针的易于使用是其主要优势之一，因此进行了电化学研究，假设使用直流电压，类似于碱性电池的电压。

施加电压时每个Mg电极的电位水平。与纯Mg的开路电位相比，随着施加电压的增加，Mg阳极的电位略微向正方向移动，而Mg阴极的电位水平在开路电位的基础上显著向负方向移动。阳极和阴极之间的电位差几乎等于施加的电压。
电位移动的方向受过电位的影响，根据Tafel方程，过电位随着电流密度的增加而增加。η：过电位，A：Tafel斜率，i：电流密度，i0：交换电流密度。
施加的电压越大，Mg电极上的化学反应就越激烈。

随着施加电压的增加，Mg电极上生成的H2量也增加。H2在Mg电极表面迅速生成，随着时间的推移逐渐减少。在建立最佳电位范围时，将30分钟、1小时和2小时后的H2量重新整理，作为施加电压的函数。在1.2 V或更高的施加电压下，H2生成非常迅速，电极在1到2小时之间完全溶解，进一步测量是不可能的。
在1.0 V以下的施加电压范围内，H2的生成量在30分钟和1小时内随着施加电压的增加而缓慢增加。在1.0 V以下的范围内，可以预期H2的生成不会过于激烈，以防止药物沿着Mg微针或微通道的表面输送以及在组织中扩散。
合金比纯Mg更常用，因为它们具有更优异的耐蚀性和强度。Mg-Ca-Zn合金由于其优异的生物相容性、可生物降解性以及控制腐蚀速率和强度的特性而成为活跃的生物材料研究对象。作为一个示例研究，选择了镁-0.05钙-1锌合金，并以与纯Mg相同的方式测量了其电位水平和H2生成量。

镁-0.05钙-1锌电极的电位水平与纯Mg电极类似地移动。随着施加电压的增加，镁-0.05钙-1锌电极上的H2生成量也增加，值得注意的是1.2 V下生成的H2量几乎与纯Mg在1.0 V下的相同，并且在1.4 V以下没有显著增加。可以推断镁-0.05钙-1锌合金微针在1.2 V以下可能显示出相同或更优越的性能，甚至可以在1.4 V下使用。
为了测试Mg电极在离子电转运中的功效并确定最佳电压范围，使用了罗丹明B溶液进行了染料透过实验，而不是使用实际药物。该溶液通过滴涂法加载在猪皮肤表面上,将Mg微针电极贴附在染料涂层的猪皮样本上，并施加电压进行1小时。

离子电转运效果可以肉眼清晰地观察到：在对照样本中，染料仅通过扩散进入皮肤，而在施加电压的情况下，染料可以深入和迁移更远。先前的离子电转运研究已经在微针电极上以0.2-0.5 mA cm^-2的电流密度下进行，以避免对人体皮肤的损伤。
在本研究中，0.8 V的应用电压相当于上述范围内的0.43 mA cm^-2的电流密度，且随时间变化不明显。由于猪皮肤表面的粗糙和不规则性，对染色区域进行了统计分析。在接近Mg微针阳极的光学横截面图像中，提取并使用ImageJ软件量化了染色区域。
施加电压下的染色区域比仅依靠扩散而无电压的对照组大。随着施加电压的增加，染料被输送到更广泛的区域，但在1.4 V时染色区域减小。在轻微H2生成范围内，施加电压对染料的推动效果占主导地位，但更高的电压（1.4 V及以上）会导致活跃的H2生成，中断染料在离子电转运过程中的迁移，而不是推动染料进一步深入。

在离子电转运过程中，带正电荧光素B染料的迁移受到电场的强烈影响。在未施加电压的情况下，预期染料将均匀渗透到猪皮样本中，而当施加电压时，染料在阳极附近会主要朝向阴极的方向迁移。
对照组中的染料呈现红色，停留在表面，而在阳极附近的染料则在电场的作用下不对称地被推向阴极。染料在0.8 V时朝阴极进一步迁移，并且颜色较0.2 V时较浅，这是因为在更强的电场作用下，相同量的染料溶液应该能够渗透得更远。
扫描电子显微镜图像显示，在0.8 V的电压下，阳极和阴极Mg微针电极贴附在猪皮样本上1小时后存在明显的差异。阳极的针尖被腐蚀并消失，而阴极的形状在离子电转运过程中几乎保持不变,能量散射光谱结果显示阳极中的氧含量更高。

SEM图像显示了不同施加电压下的腐蚀的阳极Mg微针电极。随着施加电压的增加，腐蚀程度加剧，检测到更多的氧含量。在0.8 V下，只有针尖消失，并显示了最大的染色区域，而在1.4 V下，针头在1小时内几乎完全消失。
正如前面讨论的，染料迁移在1.4 V下减少，这归因于离子电转运过程中H2生成的突然增加。考虑到1.4 V下的阳极图像，还可以推断随着时间的推移，阳极微针电极被腐蚀并逐渐消失，导致染料在沿着阳极微针电极的猪皮肤中的扩散变得更加困难。
就像其他离子电转运的研究一样，本研究使用了罗丹明B染料便于直观地显示电场效应。许多药物分子具有负电荷，因此它们在离子电转运过程中会从阴极迁移到阳极。分别测量了每个Mg电极上的H2生成量,随着施加电压的增加，阴极处的H2生成量增加，但远远少于阳极处的H2生成量。

这意味着负电荷药物可以使用施加电压高达1.6 V的Mg微针电极进行输送，因为H2生成速率较慢且阴极微针电极在1小时内保持其形状。氧化氢也是由于Mg的腐蚀而生成的。随着施加电压的增加，即H2生成量的增加，H2O2的生成量减少，这似乎是由Mg离子引起的pH变化。
▶三、总结
本研究通过将微针技术和离子电转运相结合，研究了生物相容性和可降解的Mg电极以提高经皮递送。Mg微针电极形成了足够深的微通道，可将药物递送到皮肤内部。在离子电转运过程中，测量了Mg和基于Mg的合金的电位水平，并根据H2生成量建立了它们的最佳电压范围。
染料在猪皮样本上的渗透实验证明了Mg电极在离子电转运中的有效性。随着施加电压的增加，染料的迁移距离增加，但高电压下过量的H2生成和微针电极的腐蚀阻碍了染料的输送。

通过分析每个电极上的H2生成和微针电极的腐蚀情况，清楚地表明Mg微针电极无论药物的极性如何，都适用于离子电转运的经皮递送,预计本研究将为进一步扩大可降解金属甚至用于各种电化学应用提供机会。
▶参考文献
1、M.R. Prausnitz, R. Langer，《自然生物技术》,斯普林格出版社，2008年。
2、E.R. Parker, M.P. Rao, K.L. Turner, N.C. MacDonald，《带有嵌入式微流控网络的钛材料大块微针用于经皮给药》，IEEE数字图书馆，2006年。

来源：http://www.yidianzixun.com/article/0osZEWQE
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